Cas9文库

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　　CRlSPR/Cas9是细菌和古生物菌用来反抗外来质粒或噬菌体等遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。使用CRlSPR/Cas9手艺建设哺乳动物全基因组突变库或者与某类功效相关的基因突变体库，通过功效性筛选和富集以及随后的PCR扩zeng和深度测序剖析，掘客与筛选表型相关的基因，称为CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选。gRNA文库是药物筛选或靶向筛选特定通路的理想工具，gRNA文库的建设将在功效基因筛选、疾病机制研究及药物研发等方面施展主要的功效。

　　

　　CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选流程分为五步，即gRNA文库选择、gRNA文库扩zeng、gRNA文库慢病毒包装、gRNA文库筛选、PCR扩zeng和NGS测序

　　

　　1、gRNA文库选择

　　

　　首先客户选择所需gRNA文库。若是客户凭证详细需要提出文库定制（小于300个基因），MRCAT猫先生体育将凭证客户提供的基因群信息举行单个基因的gRNA设计，保证每个基因设计3个差异的gRNA，最洪流平确保基因功效的突变。MRCAT猫先生体育接纳的载体是单/双慢病毒载体，单慢病毒载体是一个载体上同时携带单个gRNA和cas9基因，双慢病毒载体是一个载体上只有单个gRNA，cas9卵白则由单独携带cas9的载体提供。这两种模式载体均携带有特另外抗性筛选标志。

　　

　　2、gRNA文库扩zeng

　　

　　上述构建的载体数目较少，不足以举行文库的慢病毒包装和使用。因此，需要对上述载体举行扩zeng，zeng加总量。上述gRNA载体构建完成后，MRCAT猫先生体育将这些载体an相同的比例混淆成一个pool（即载体混淆库），随后将载体混淆库使用专用电转感受态，电转扩zeng作育并网络菌落，并举行扩大作育，最后抽提质粒，即获得了扩zeng后的载体混淆库，也就是文库。

　　

　　3、gRNA文库慢病毒包装

　　

　　扩zeng后的gRNA文库在慢病毒包装载体的辅助下转染293T细胞，举行慢病毒的包装。由于gRNA文库是由多个差异的gRNA载体混淆而成，因此MRCAT猫先生体育获得的慢病毒是混淆型病毒库，每个病毒携带单个gRNA载体。

　　

　　4、gRNA文库筛选

　　

　　对筛选的目的细胞举行病毒熏染预实验，获得细胞在较低的MOI时熏染百分数，以确认熏染时gRNA文库的病毒用量。慢病毒库以较低的MOI值熏染细胞（确保每个细胞最多进入一个慢病毒），随后凭证实验目的而对细胞接纳响应的处置赏罚，最后经由差异的筛选方式富集细胞。以耐药性基因筛选实验为例，凭证前期药物IC50实验，获得药物筛选实验的处置赏罚浓度。接纳高浓度药物处置赏罚熏染后的细胞，经由筛选后存活的细胞则具有一定的耐药性，将此群细胞扩zeng并网络下来，耐药性的泉源是CRlSPR/Cas9 gRNA对响应基因的修饰。

　　

　　5、PCR扩zeng和NGS测序

　　

　　对步骤4筛选中富集下来的细胞举行慢病毒载体的PCR扩zeng，gai扩zeng片断包罗载体所携带的gRNA序列，通事后续的NGS测序，MRCAT猫先生体育可以获得富集细胞中gRNA的富集度，从而寻找到响应的基因，这些基因很有可能加入药物作用历程，因此可作为深入研究的待选基因。

　　

　　实验流程如下：

　　gRNA文库类型：

　　其中定制gRNA文库，可凭证通路中特定基因设计gRNA：

　　

　　1)疾病相关基因：抑癌基因、原癌基因、糖尿病基因、心血管疾病基因、帕金森病基因等；

　　

　　2)信号转导通路：RAS信号通路、WNT信号通路、JAK-STAT信号通路、NF-kB信号通路、TNF信号通路等；

　　

　　3)细胞功效相关：自噬、细胞周期、细胞凋亡、血管新生、肿瘤抑制等。

　　

　　gRNA文库筛选表型：

　　

　　1)肿瘤转移相关基因筛。ㄌ迥谏秆。

　　

　　2)细胞迁徙/侵袭相关基因筛。ㄌ逋馍秆。

　　

　　3)细胞克隆形成相关基因筛。ㄌ逋馍秆。

　　

　　4)细胞zeng殖相关基因筛。ㄌ逋馍秆。

　　

　　5)肿瘤耐药相关基因筛。ㄌ逋馍秆。

　　

　　6)细胞信号通路相关基因筛。ㄌ逋馍秆。

　　

　　7)其他功效基因筛。缱允、细胞分化等

　　

　　gRNA文库应用领域：

　　

　　1)探索药物作用机制：药物靶点确定与验证

　　

　　2)寻找肿瘤治疗靶点：基因环路上下游调控机制剖析

　　

　　3)探讨代谢疾病治疗机制：代谢通路调治机制剖析

　　

　　MRCAT猫先生体育的优势：

　　

　　1)产物周全：不仅拥有人类和小鼠的全基因组gRNA现货文库，而且可以定制任何类型的特定文库，后期更有活性文库即将推出！

　　

　　2)价钱划算：现在订购gRNA文库享有一定折扣优惠，让您的实验经济、快速和高效地举行。

　　

　　3)种类多样：MRCAT猫先生体育不仅可以使用单克隆形式构建sgRNA载体，也可以使用芯片形式合成，确保最大的笼罩率。

　　

　　4)服务到位：MRCAT猫先生体育除了可以提供gRNA文库质：筒《疽酝，还可以帮您举行下一步的筛。钪仗峁┠康幕蛎。

　　

　　MRCAT猫先生体育提供的服务：

　　

　　1)质粒构建：凭证客户需求构建定制的gRNA文库质粒。

　　

　　2)病毒包装：将全库质粒或定制质粒包装成慢病毒，熏染细胞。

　　

　　2)筛选服务：客户提供筛选方案，可以为客户提供筛选服务。